BAB I
PENDAHULUAN
1.1
LATAR BELAKANG
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang memanfaatkan makhluk hidup
atau produk yang dihasilkan oleh makhluk hidup dalam proses produksi yang
meghasilkan produk barang atau jasa. Bioteknologi berkembang dengan pesat
sehingga ditemukan berbagai macam teknologi yang menggunakan makhluk hidup
seperti rekayasa genetika, kultur jaringan, kloning, rekombinasi DNA, dan
banyak bioteknologi modern lainnya. Pada perkembangannya bioteknologi telah
mencapai tingkat rekayasa yang lebih terarah sehingga produk yang dihasilkan
lebih baik dan dapat dikendalikan. Teknik ini menggunakan manipulasi DNA, salah
satunya yaitu rekombinasi DNA.
Teknik
rekombinasi DNA mengombinasikan materi genetik yang baru dengan cara memotong
kemudian menyisipkan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkan
terjadinya integrasi dan perbanyakan sel vektor pembawa DNA rekombinan ini di
dalam sel inang. Pemotongan DNA dalam teknik rekombinasi DNA ini menggunakan
suatu enzim yaitu enzim restriksi endonuklease. Enzim restriksi endonuklease
memunyai kemampuan memotong urutan nukleotida pada basa-basa secara spesifik
sehingga pemotongannya bersifat terarah.
Teknik
rekombinasi DNA sangat bermanfaat terutama untuk bidang kesehatan. Beberapa
produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi manusia, diantaranya : insulin
untuk penderita diabetes, faktor VIII untuk laki-laki menderita hemofilia a,
faktor IX untuk hemofilia b, hormon pertumbuhan manusia (hgh), Erythropoietin
(epo) untuk mengobati anemia, dan Granulocytemacrophage colonystimulating
factor (gmcsf) untuk menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum
tulang.
Penemuan
dan perkembangan teknik rekombinasi DNA beserta metode dan langkah-langkah
pelaksanaannya menjadi suatu terobosan untuk menyelesaikan masalah dalam bidang
kesehatan sehingga dapat menjadi manfaat bagi manusia.
1.2 RUMUSAN MASALAH
1.
Apa
yang dimaksud dengan rekombinasi DNA?
2.
Apa
yang dimaksud dengan enzim restriksi endonuklease?
3.
Bagaimana
pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease pada teknik rekombinasi
DNA?
1.3 TUJUAN PENULISAN
1.
Mengetahui
maksud dari rekombinasi DNA
2.
Mengetahui
maksud dari enzim restriksi endonuklease
3.
Mengetahui
pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi endonuklesae pada teknik rekombinasi
DNA
1.4 MANFAAT PENULISAN
Manfaat yang dapat diambil bagi
penulis dan seluruh pembaca dari penulisan makalah ini adalah dapat
meningkatkan pengetahuan mengenai bioteknologi modern terutama teknik
rekombinasi DNA dan cara pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi
endonuklease.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Rekombinasi DNA
Salah satu
bioteknologi modern yang sering dimanfaatkan dan diaplikasikan dalam berbagai
bidang yaitu teknik rekombinasi DNA. Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa
genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen
tertentu dengan DNA genom (Muhaimin Rifa’i, 2010). Dengan teknik rekombinasi
DNA didapatkan sifat baru yang diinginkan. Teknik ini meliputi penyusunan
kembali dalam dan antara molekul DNA yang terjadi melalui beberapa proses
isolasi DNA, teknik memotong DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease,
teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Setelah
DNA rekombinan terbentuk, maka dilakukan proses transformasi ke dalam sel inang
dan proses inkubasi sel bakteri tersebut. Setelah dilakukan proses inkubasi,
sel bakteri inang tersebut dilaukan uji coba adanya DNA rekombinan melalui uji
antibiotik, uji medium seleksi, dan uji putih biru. Jika sel inang bakteri
tersebut telah lulus uji dan didapatkan bakteri dengan rekombinasi DNA, maka dilakukan
purifikasi untuk mengisolasi gen yang direplikasi.
Rekombinasi
terjadi akibat adanya perubahan susunan basa nitrogen dan sifat yang dibawa
oleh suatu individu berbeda dari sifat parentalnya. Rekombinan terjadi secara
alami, baik melalui induksi, transformasi, konjugasi, maupun akibat dari adanya
suatu crossing over saat meiosis. Rekombinasi DNA dapat terjadi baik
secara alami maupun buatan oleh manusia (Muhaimin Rifa’i, 2010).
Teknologi
rekombinasi DNA mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi DNA dan
mempelajari masing-masing genakan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan
kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen yang
dengan sifat yang diinginkan dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
daripada produksi secara konvensional.
Aplikasi teknik
rekombinasi DNA dalam bioteknologi adalah produksi vaksin, insulin, antibodi,
dan sebagainya. Beberapa produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi
manusia, diantaranya:
1.
Insulin
untuk penderita diabetes
2.
Faktor
VIII untuk lakilaki menderita hemofilia a
dan faktor IX untuk hemofilia b
3.
Hormon
pertumbuhan manusia (hgh)
4.
Erythropoietin
(epo) untuk mengobati anemia
5.
Beberapa
jenis interferon dan interleukin
6.
Granulocytemacrophage
colonystimulating factor (gmcsf) untuk
menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang
7.
Granulocyte
olonistimulating factor (gcsf) untuk
merangsang neutrofil produksi, misalnya, setelah kemoterapi dan untuk memobilisasi sel induk hematopoietik dari
sumsum tulang ke dalam darah.
8.
Aktivator
plasminogen jaringan (tpa) untuk melarutkan gumpalan darah Adenosin deaminase
(ada) untuk mengobati beberapa bentuk severe combined immunodeficiency
(scid)
9.
Hormon
paratiroid
10.
Beberapa
antibodi monoklonal
11.
Antigen
permukaan hepatitis B untuk vaksinasi terhadap virus hepatitis B
12.
C1
inhibitor (c1inh) digunakan untuk mengobati
edema angioneurotic turun-temurun.
2.2 Enzim Restriksi Endonuklease
Enzim
endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat mengenali dan memotong
kedua utas DNA (Deoxy Ribonucleic Acid) pada urutan basa tertentu.
Enzim ini mencari sekuens spesifiknya dengan cara menempel pada DNA
secara spesifik maupun nonspesifik, kemudian berdifusi secara linier dengan
kecepatan tertentu hingga ditemukan sekuens spesifik yang dikenalinya. Proses
tersebut dipengaruhi oleh keberadaan ion Mg2+. Setelah sekuens spesifik
dikenali, perubahan konformasi enzim dan DNA akan terjadi (Pingoud et al,,
1993).
Enzim
restriksi endonuklease ditemukan oleh Werner Arber pada tahun 1962, kemudian
dipurifikasi dan dikarakterisasi oleh Nathans dan H. Smith pada tahun 1974
(Alberts et al.,1983). Sekarang enzim ini telah ditemukan hingga 3000 jenis.
Sumber
enzim restriksi endonuklease yaitu pada bakteri. Namun, enzim ini juga dapat
diisolasi dari virus, archaea, dan eukariota (Pingoud et al., 1993). Pada
mikroorganisme enzim ini berperan menghancurkan DNA asing yang masuk seperti
infeksi bakteriofage dengan cara memotong DNA asing tersebut pada sekuens yang
dikenalinya. Dengan demikian, kehadiran enzim ini pada mikroorganisme merupakan
suatu mekanisme pertahanan hidup organisme dari DNA asing.
Tabel
1. Sumber enzim endonuklease restriksi dari organisme (Brown, 1990)
Enzim
restriksi endonuklease diklasifikasikan menjadi tiga tipe. Ketiga tipe ini
dibedakan berdasarkan komposisi subunit, kofaktor yang diperlukan, dan cara
pemotongannya. Ketiga tipe tersebut adalah tipe I (EC 3.1.21.3), tipe II (EC
3.1.21.4), dan tipe III (EC 3.1.21.5)
Tabel
2. Klasifikasi endonuklease restriksi (Pingoud et al.,1993)
Enzim restriksi endonuklease
membutuhkan beberapa kondisi tertentu untuk menghasilkan pemotongan yang
optimum. Parameter-parameter tersebut adalah:
1.
Suhu
Sebagian besar
enzim endonuklease restriksi memiliki suhu optimum sekitar 37°C. Beberapa enzim
restriksi yang diperoleh dari bakteri thermofilik memiliki aktivitas pemotongan
optimum pada suhu tinggi (Pingoud et al., 1993).
2.
pH
Hampir semua
enzim restriksi bekerja dengan baik pada kisaran pH 7.2-8.0 (Pingoud et al.,
1993).
3.
Kekuatan
ionik
Hampir semua enzim
restriksi dapat menerima kekuatan ionik dari NaCl (50-150 mM) maupun KCl
(10-150 mM), namun beberapa enzim restriksi hanya aktif pada kekuatan ionik
yang diberikan oleh KCl, seperti enzim SmaI (Pingoud et al., 1993).
4.
Pengaruh
kation
Ion Mg2+
diduga berperan sebagai aktivator molekul air untuk membentuk nukleofil yang
dibutuhkan atau untuk menyebabkan polarisasi ikatan fosfodiester yang akan
dipotong (Pingoud et al., 1993). Konsentrasi optimum sekitar 5-10 mM MgCl2.
5.
Waktu
reaksi
Lamanya waktu
reaksi enzim ditentukan oleh unit aktivitas enzim. Enzim yang memiliki unit
aktivitas tinggi tidak membutuhkan waktu reaksi yang terlalu lama. Satu unit
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memotong (digest)
1 μg DNA fage lambda dalam waktu 1 jam dengan total volume reaksi sebesar 50 μl
(Sambrook et al., 1989).
6.
Aditif
penstabil
Enzim restriksi
juga memiliki kebutuhan akan aditif penstabil untuk mencegah terjadinya
oksidasi residu sistein. Aditif yang umum digunakan
adalah
1,4-dithiothreitol, 1,4-dithioeritritol, atau β-merkaptoetanol. Selain itu,
aditif juga berfungsi mencegah terjadinya agregasi dan presipitasi. Dalam hal
ini, aditif yang umum digunakan adalah Tween, Lubrol, Triton X-100, deterjen
lainnya, atau Bovine Serum Albumin (BSA)
(Pingoud et al., 1993).
2.3 Pemotongan DNA Menggunakan Enzim
Restriksi Endonuklease
Rekombinasi
DNA dilakukan melalui beberapa tahapan. Secara garis besar tahapan ini meliputi
pengisolasian DNA, kemudian memotong DNA menggunakan enzim restriksi
endonuklease, menggabung DNA dengan enzim ligase, dan memasukkan DNA rekombinan
ke dalam sel hidup untuk berproliferasi.
Prosedur
kloning. DNA bakteri dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dan
disisipkan kepada plasmid. Kemudian plasmid rekombinan dimasukkan dalam sel
inang dan sel yang membawa plasmid rekombinan diidentifikasi dan ditumbuhkan
(Glick dan Pasternak, 1998).
Tempat
pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang
basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan
fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai
tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang
runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering
pula disebut sebagai ujung lengket (sticky
end) atau ujung kohesif. Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae
III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen
hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing
untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk
disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya
pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Setiap
enzim restriksi endonuklease dapat mengenali, mengikat, dan memotong urutan
basa tertentu. Urutan basa yang dipotong biasanya terdiri dari 4-8 pasang basa
dan enzim restriksi endonuklease hanya memotong DNA yang mempunyai urutan basa
yang benar-benar persis dengan kode tersebut. Sebagai contohnya yaitu urutan
basa yang dikenal oleh enzim EcoRI adalah GAATTC. Semua situs yang mempunyai
urutan basa GAATTC akan dipotong oleh EcoRI. Proses pemotongan DNA dengan enzim
restriksi endonuklease dapat menghasilkan potongan asimetris 5’ atau 3’ terbuka
sehingga ujungnya kohesif (sticky end) ataupun potongan simetris
sehingga ujungnya tumpul (blunt end) (Grompe et al., 1998).
Adapun
cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II
telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam
protein sekunder dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam
bentuk α-heliks. Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan scanning
pada untaian molekul DNA. Jika tidak menemukan restriction sites yang
spesifik peristiwa tersrbut dinamakan mekanisme slidding. Mekanisme slidding
tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim restriksi
endonuklease tersebut akan mengubah konformasinya ketika mengenali daerah restriction
sites yang spesifik. Ketika sudah mengenali daerah spesidik, maka enzim
tersebut akan memotong dua ikatan gula deoksiribisa dengan fosfat dari double
helix DNA yang berbeda dengan menghasilkan gugus 3’ hidroksil (OH) dan gugs 5’
fosfat (PO4-). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai
dengan daerah pemotongannya (Allison, 2007; Reece, 2004).
BAB III
PENUTUP
3.1
SIMPULAN
Simpulan yang
didapatkan dari pembahasan pada tinjauan pustaka adalah:
1.
Teknik
DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan
cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Dengan teknik rekombinasi
DNA didapatkan sifat baru yang diinginkan. Teknik ini meliputi penyusunan
kembali dalam dan antara molekul DNA yang terjadi melalui beberapa proses
isolasi DNA, teknik memotong DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease,
teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup.
2.
Enzim
endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat mengenali dan memotong
kedua utas DNA (Deoxy Ribonucleic Acid) pada urutan basa tertentu.
Enzim ini mencari sekuens spesifiknya dengan cara menempel pada DNA
secara spesifik maupun nonspesifik, kemudian berdifusi secara linier dengan
kecepatan tertentu hingga ditemukan sekuens spesifik yang dikenalinya.
Proses tersebut dipengaruhi oleh keberadaan ion Mg2+. Setelah
sekuens spesifik dikenali, perubahan konformasi enzim dan DNA akan terjadi.
Sumber enzim restriksi endonuklease yaitu pada bakteri. Namun, enzim ini juga
dapat diisolasi dari virus, archaea, dan eukariota.
3.
Cara
kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim endonuklease tipe II
telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya tersusun atas 5 macam
protein sekunder dalam bentuk β-sheet yang diapit oleh 2 protein sekunder dalam
bentuk α-heliks. Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan scanning
pada untain molekul DNA jika tidak menemukan restriction sites yang
spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding. Mekanisme sliding
tersebut melibatkan pergerakan di sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim restriksi endonuklease tersebut
akan mengubah konformasinya ketika mengenali daerah restriction sites
yang spesifik. Ketika sudah mengenali daerah spesifik, maka enzim tersebut akan
memotong dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helix
DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3′ hidroksil (OH) dan gugus 5′ fosfat
(PO4-). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai
dengan daerah pemotongannya (Allison, 2007; Reece, 2004).
3.2
SARAN
Saran
ditujukan kepada pembaca dan peneliti lain agar lebih meningkatkan wawasan ilmu
pengetahuan serta mengembangkan teknik rekombinasi DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Rifa’i,
Muhaimin. 2010. Genetika Rekombinasi dan Populasi. Malang: Galaxy
Science.
Glick, .R &
J.J. Pasternak. 2003. Molecular Biotechnoligy Principles and Applications of
Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press.
Pingoud , A.,
J. Alves & R. Greiger. 1993. Restriction Enzymes. New Jersey: Press
Inc.
Grompe M.,
Johnson W., & Jameson L. 1998. Recombinant DNA and Techniques. New
Jersey: Press Inc.
Alberts., B.,
D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J.D. Watson. 1983. Molecular
Biology of The Cell. New York: Garland Publishing.
Brown, T.A.
1990. Gene Cloning : An Introduction, 2nd Edition. London:
Chapman and Hall.
Sambrook, J.,
E.F. Fristch & T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Reece, J.
Richard. 2004. Analysis of Genes and Genomes. England: Wiley.
Komentar
Posting Komentar